甲基化检测介绍

原理与应用:

甲基化是在DNA甲基转移酶（DNA Methyltransferase, DNMT）催化作用下, 利用S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)提供甲基，在CpG二核苷酸中胞嘧啶嘧啶环的五号碳原子上加上甲基的共价修饰过程。DNA甲基化修饰现象广泛存在于多种有机体中，是最早发现的修 饰途径之一，是表观遗传学(Epigenetics)的重要组成部分。大量研究表明，DNA甲基化不改变DNA的一级结构，但是能引起染色质结构、DNA 构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，从而在基因的表达及其调控、DNA的复制、细胞的生长发育、X染色体失活、衰老以及许多人类疾病 (如发育畸形、癌症、心血管疾病、糖尿病和神经心理失调等)发生过程中发挥重要作用。 DNA的甲基化主要形成5-甲基胞嘧啶和少量的N6- 甲基腺嘌呤及7-甲基鸟嘌呤。在高等生物中，5-甲基胞嘧啶多发于CpG二核苷酸序列中，基因组中60%-90%的CpG是甲基化的。在甲基转移酶 (DNMT)的催化作用下，利用S-腺苷甲硫氨酸(SAM)提供的甲基，使CpG二核苷酸序列中的胞嘧啶转变为5-甲基胞嘧啶。由于甲基化胞嘧啶极易在进 化中丢失，高等真核生物中CpG序列远远低于其理论值，但在基因组的某些区域中，通常是基因的启动子和第一外显子区，CpG序列密度很高，可以达均值的5 倍以上，成为鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区，形成所谓的CpG岛。哺乳类基因组中约存在4万个CpG岛，大多位于转录单元的5’区。CpG岛的高甲基化是肿瘤中 存在的普遍现象，而启动子CpG 岛的高甲基化是除突变和缺失外肿瘤中抑癌基因失活的第三种机制。因此，基因启动子甲基化检测在临床诊断、药物敏感性检测等方面具有很高的应用价值。

服务项目：

• BSP分析
• Msp分析
• QMSP分析
• 焦磷酸测序法进行甲基化分析
• 甲基化芯片(QIAGEN EpiTect Methyl PCR Arrays)

检测方法：

亚硫酸盐修饰克隆测序法，巢式PCR法，荧光定量PCR法，焦磷酸测序法，PCR芯片。

仪器设备：

使用美国ABI公司的9700 PCR仪和Step-one PLUS realtime RCR System为主的PCR装置及QIAGEN公司PyroMark Q96 ID焦磷酸测序仪。

服务项目：

1. 亚硫酸盐测序法 (bisulfite sequencing PCR, BSP)

先抽提基因组DNA，再进行亚硫酸盐修饰，甲基化PCR后装克隆，通过最后对PCR产物进行克隆测序，可以得到目的片段中每个CG位点的甲基化情况，这种 方法更加准确，所以目前BSP法受到更多研究者的青睐！ 最后通过对测序结果分析, 可以得到如下数据:

1. 测序序列与目的序列的相似度（%）
2. C-T转化效率（%）
3. 目的序列中每个CG的甲基化情况（点状图）
4. 目的序列中每个CG的甲基化比例（%）（柱状图）

2.甲基化特异性PCR (methylation-specific PCR，MSP)

甲基化特异性PCR(Methylmion Specific PCR，MSP)及其改进方法是检测基因甲基化的经典方法．MSP法的原理是首先用亚硫酸氢钠修饰处理基因组DNA，所有未发生甲基化的胞嘧啶都被转化为 尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则不变。然后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物并进行聚合酶链反应(PCR)扩增，最后通过琼脂糖凝胶电泳分析，确定与引物互补的DNA序列的甲基化状态。

3.QMSP分析

QMSP是采用荧光定量的方法进行甲基化分析，可确切定量出甲基化的比例。但具体方法没有标准，详情请电联我们的技术服务人员。

4.焦磷酸测序法（Pyrosequencing）分析

焦磷酸测序（Pyrosequencing）技术可以给出启动子一段区域绝对的测序结果和甲基化程度的精确比率、可以说是甲基化检测的金标准，是甲基化精 确定量的检测平台，它不仅能测定邻近CpG区域的单个甲基化水平，甚至还包括测序的引物区域。

5.甲基化芯片(QIAGEN EpiTect Methyl PCR Arrays)

使用MethylScreen™ 技术，无需亚硫酸氢盐转化，适用于信号通路或疾病相关的区域DNA甲基化分析。可实现单个基因以及疾病和信号通路相关的一组基因中CpG 岛DNA 甲基化的快速准确检测。该技术无需亚硫酸氢盐转化。通过一步简单的限制性内切酶消化然后进行实时定量PCR，即可利用DNA Methylation PCR Array 同时分析22 个或94 个不同基因的DNA 甲基化水平。操作过程的简单让这个技术非常适合DNA 甲基化图谱分析和生物标志物鉴定。

EpiTect Methyl II PCR System 提供：

1. 对照限制性消化与qPCR 检测的联合可靠性
2. 全基因组、即用型、预设计的引物分析
3. 单次qPCR 运行中多个目标的同时分析
4. 网页式且自动化的免费数据分析工具
5. 用于监控限制性内切酶酶活的参照
   

实验流程及服务要求：

1. 如果您需要进行此项服务,请电话联系我们公司或发送E-mail给我们。
2. 请寄送足量的并且保证纯度的基因组DNA(浓度在500 ng/μl以上，体积在 20 μl以上)。
3. 如果提供的材料为细胞或组织，DNA的提取费用另收。 同时应保证材料新鲜，动物细胞数为106以上，动物组织为100 mg以上。